Da oggi più facile l’editing genomico

Un team internazionale di ricercatori ha reso la tecnologia CRISPR più accessibile e standardizzata semplificando la sua complessa implementazione. Il CRISPR più semplice e veloce, presentato sulla rivista “Nature Communications”, offre un’ampia piattaforma per l’ingegneria del genoma off-the-shelf che può ridurre la barriera di accesso a questa potente tecnologia.
“Le tecnologie CRISPR possono essere programmate per mirare specifiche sequenze di codice genetico e per modificare il DNA in posizioni precise, consentendo così agli scienziati di modificare permanentemente i geni nelle cellule viventi e nei modelli di organismi per esplorare la funzione genica in laboratorio, compresi i geni associati alla malattia umana, “Ha detto il co-autore di primo piano il dott. David Marciano, istruttore del laboratorio Olivier Lichtarge del Baylor College of Medicine.
“Queste tecnologie consentono a un complesso di ribonucleoproteine ​​di scindere il DNA in una sequenza specifica che si basa su coppie con un RNA guida nel complesso. La modularità del complesso acido nucleico / proteina consente ai ricercatori di specificare la sequenza RNA guida per colpire quasi ogni sequenza. Ciò migliora notevolmente la capacità dei ricercatori di modificare il DNA”, ha affermato il co-autore di primo piano Dr. Toon Swings, scienziato post-dottorato nel laboratorio Jan Michiels del Vib-KU Leuven Center for Microbiology.
Tuttavia, questo approccio presenta alcune sfide, come i vincoli sulle sequenze che possono essere mirate, la possibilità di effetti fuori bersaglio e il requisito di un RNA guida unico per ogni gene bersaglio. Marciano, Swings e i loro colleghi hanno stabilito una collaborazione internazionale che ha portato a una soluzione semplice che aggira tutti questi problemi.
“Toon e io avevamo una serie di progetti in cui dovevamo costruire molte mutazioni e guidare gli RNA per diversi geni nel batterio E. coli. Ci siamo resi conto che non avremmo avuto bisogno di un nuovo RNA guida per ciascun gene se avessimo appena preso di mira una sequenza universale trovata in collezioni di knockout genetici. La sequenza che abbiamo preso di mira si trova in molte collezioni genetiche di batteri importanti dal punto di vista medico ed è presente anche in alcune raccolte di mosche “, ha detto Marciano.
I ricercatori hanno usato una libreria di cloni di E. coli chiamata la collezione Keio. Ogni clone in questa collezione ha avuto un gene sostituito da un gene di resistenza alla kanamicina. La collezione è stata resa disponibile nel 2006 attraverso una collaborazione internazionale tra la Keio University of Japan e la Purdue University negli Stati Uniti.
“Abbiamo finito per riproporre questa preziosa risorsa prendendo di mira i due siti FRT che fiancheggiavano la cassetta della kanamicina della collezione. Questo funziona bene perché ti dà due tagli, che è più difficile da fuggire “, ha detto Swings.
Il loro approccio evita alcuni aspetti tecnici di CRISPR e lo rende disponibile come ingrediente off-the-shelf per l’ingegneria genetica. Rimuove la necessità di progettare e clonare un RNA guida e semplifica la strategia per la costruzione di un modello di salvataggio. Inoltre, la collezione Keio può essere trovata nei laboratori di tutto il mondo e i singoli cloni sono disponibili a un costo nominale dai centri di stock genetici centralizzati.
Il nuovo lavoro presenta anche l’ampia utilità dell’approccio mostrando che è possibile indirizzare i geni che sono essenziali alla vita, creare una vasta collezione di organismi con diverse mutazioni in un singolo gene cromosomico e aggiungere nuove sequenze su un gene, tutto nel contesto naturale del gene. Il metodo dovrebbe integrare le tecniche esistenti per l’ingegneria genetica di E. coli.
“Molti organismi modello, oltre a E. coli, hanno raccolte di sostituzioni o inserimenti di geni che potrebbero essere presi di mira da un singolo RNA guida in modo simile”, ha detto Swings. “Ci auguriamo che il nostro lavoro fornisca un’ampia piattaforma per una varietà di approcci di ingegneria genetica”.
“Questo è un bell’esempio del potere della genetica batterica. È qui che CRISPR è stato scoperto per la prima volta, e ora un’altra tecnologia batterica potrebbe renderla ancora più utile “, ha detto l’autore corrispondente Dr. Olivier Lichtarge, Cullen Chair of Molecular and Human Genetics e professore di biochimica e biologia molecolare e farmacologia Baylor College of Medicine. Lichtarge è anche membro del Centro per la lotta contro i tumori di Dan L Duncan a Baylor.
“La piattaforma sviluppata basata sulla tecnologia CRISPR sarà preziosa per molti ricercatori in microbiologia permettendo loro di eseguire un rapido editing a singolo nucleotide dei loro geni di interesse o di generare raccolte di cromosomi mutanti, uno dei primi passi nella comprensione della funzione genica”, ha detto l’autore corrispondente Dr. Jan Michiels, capogruppo del Vib-KU Leuven Center for Microbiology e professore di biochimica e microbiologia molecolare all’Università di Leuven.